SRP: Blodpropper i hjernen og behandlingsformer

Skrevet af: Alexander Kruhøffer Bloch Andersen

Indledning

Den dag i dag er der mange læger, som specialiserer sig i behandlingen af tromber. Dette sker hovedsageligt i forlængelse af, at der i det postmoderne samfund gennem bl.a. stress, rygning, usund kost mm.(hvilket kan kategorisere det som en livsstilssygdom), har en større tendens til at danne tromber og derved være i risikozonen for at få slagtilfælde. Alene i USA er det angivet at der hvert år er 700 000 mennesker, som får iskæmisk slagtilfælde, hvilket vil sige at de får et slagtilfælde grundet manglende ilttilførsel, hvilket sker ved tromber, da disse danner en blokade i vitale organer, så som hjernen. Det er også angivet at der er mellem 8-12 % af de mennesker, som før inden for 30 dage, altså det svarer til mellem 56 000 og 84 000 årligt. I Danmark er det kun 200 af 100 000 som bliver ramt, altså 0,2 % hvert år.

Derfor er det stadig et studie, som der bliver studeret meget i, da man kan udvikle nyere og bedre midler til forebyggelse og helbredelse.

Et af de nyere medikamenter, som stadig er under udvikling, er enzymet desmoteplase, som findes i vampyrflagermusen, desmodus rontundus. Vampyrflagermusen benytter sig af det enzym til at fastholde blodet i flydende form, så flagermusen kan drikke i længere tid.

Derfor vil jeg løse følgende opgaver:

• Gør kort rede for hvad apopleksi er og hvorfor det opstår
• Gøre rede for behandlingsformen, der anvendes i dag til trombolysebehandling og forklar hvilke nye muligheder der tegner sig i fremtiden.
• Skitser hvordan rekombinante enzymer, der anvendes til trombolysebehandling (eksempelvis alterplase og desmoteplase) kan reproduceres, og skitser hvordan enzymerne kan oprenses

Abstract

One of the big fatal or disabling factors in our postmodern age is blood clots, also known as thromboses that form in the brain and course an ischemic stroke, also known as an apoplectic stroke (or just a stroke). The treatment of such strokes does have complications, because the time limit for the treatment to begin is only 4-6 hours. Beyond that time, there is a guarantee that the person will suffer from heavy brain damages. But scientists still do research for finding a way to save those people, through giving them a longer time limit and a more effective treatment. The typical stroke is coursed by either emboli or a thrombosis. Emboli is collected LDL-cholesterol and platelets, that is formed on the side of the blood vessel walls and eventually rip off and travel the veins to get clogged in one of the smaller veins. A thrombosis is a mass of fibrin and platelets that is usually formed at a spot, where a vein has been broken. The fibrin is then activated and eventually forms a clot to prevent blood from circulating and deliver nutrition to the cells. The most common main treatment in Danish hospitals is aspirin at first. Aspirin is though never given alone, because the side effects can be strong, so it is usually given with something to either ease or prevent the side effects. But after the use of aspirin, the most used direct treatment is the use of alteplase, which is an enzyme that works as a tissue-plasminogen-activator (tPA), which is common in the veins. But a new effective enzyme has been discovered in the form of desmoteplase, which was found in the salvia of the vampire bat desmotus ronduntus. But now is the problem of reproducing these enzymes. First off we need the DNA-sequence coding for the protein, which forms the enzyme. That is either done two ways: the first way is to go through a four step phase: reverse translation, extraction of DNA, PCR and centrifugal. The second way is through simply reverse transcription. Then I got three possible solutions to how to reproduce the r-tPA: first possibility is to let the host cell absorb the DNA-sequence through osmosis. The second possibility is to manually insert the DNA-strand in the cell before mitosis. And the final possibility is to insert the DNA-sequence through transduction with the use of a retrovirus. Afterwards there is the purification of the protein. It could be done with gel electrophoresis or though column chromatography. And finally there is the identification of the protein: I could only suggest an Edman-degradation or an x-ray crystallography. My conclusion is that there are problems with all of the solutions that I have given, like the reverse translation is long and difficult to make and the Edman-degradation is most effective on short proteins. I would keep to the reverse transcription, transduction and column chromatography, while I am insecure about the processes of the protein identification. I therefore am glad that the scientists know more of this than I do.

Hvad er apopleksi?

Apopleksi (apoplexia cerebri) er betegnelsen for en cerebral iskæmi med andre ord et område i hjernen, som lider under manglende eller nedsat blodforsyning. I hjernen sker det dog sjældent ved andre tilstedeværelsen end ved en blodprop, mens det i hjertet for det meste skyldes for lavt blodtryk eller indsnævrede pulsåre. Typen af apopleksi defineres ud fra varigheden af symptomerne og skadernes omfang: I tilfældet af at symptomerne varer under 24 timer, omtales det som transitorisk cerebral iskæmi (TCI), altså en midlertidig periode, hvor et område i hjernen lider af nedsat blodforsyning; hvis symptomerne derimod varer i længere tid end 24 timer, er der tale om et reelt tilfælde af apopleksi Symptomerne på dette varierer mest fra hvilke områder af hjernen, der bliver udsat, størrelsen af blodproppen, opløseligheden af blodproppen, samt blodtilførelsen til det udsatte område. Men de mest kendte symptomer ved apopleksi er en ekstrem hovedpine, svimmelhed og eventuelt bevidstløshed. (kilde nr. 24).

Indenfor apopleksi tilfældet findes der to typer af blodpropper: der findes dem, som dannes og sætter sig lokalt et sted dannet af fibrin og blodplader, også kaldet tromber; så er der dem, som kan dannes et sted, men som løsriver sig fra et af halskarrernes vægge eller fra et af hjerte arterierne og følger med blodstrømmen, også kaldet embolier. (kilde nr. 4 side 53-54 og nr. 25)

Embolierne bliver dannet af LDL-kolesterol[1], som er den ene ud af to kolesterol typer af lipider (den anden er HDL), som produceres i leveren. Det kan sætte sig på karvæggenes endothel[2] og inddrager nogle af de hvide blodlegemer som sidder på karvæggen kaldet monocytter (se figur 1 i bilaget). Derefter bliver den beklædt med nogle af endothellets blodplader og med årene bliver de også kalkbelagte, i dette tilfælde kalder man det for åreforkalkning. En emboli kan rive sig løs og følge strømmen til den når en forsnævring enten forårsaget af andre embolier på karvæggen eller en mindre blodåre end den kom fra. Embolierne kan man ikke med sikkerhed bestemme, hvor den er dannet henne, da de efter at de er løsrevet følger med blodstrømmen indtil at den møder modstand. (kilde nr. 9 side 106)

Tromberne bliver dannet på en anden måde. De forekommer i steder i blodårene, hvor der har været et brud. Ved bruddet aktiveres en koagulationsfaktor[3], som hedder F-XII_a, som sender signal til leveren om at aktivere koagulationsfaktor F-X_a, som spalter prothrombin til thrombin. Thrombin er et serinprotease[4], som omdanner det frie fibrinogen i blodet til det geleagtige fibrin. Thrombinen fungere ved at den afskærer fibrinogenets fibrinopeptid A og B fra fibrinogenets Aα-kæde og Bβ-kæde, som vist på figur 2 i bilaget. Hydrolysen er med til at blotlægge område E, som derved kan danne en disulfid binding med et af D-områderne på et andet fibrin. Så går det fra at være en fibrinmonomer til at være en fibrin-dimer. Bindingsprocessen fortsætter, så det bliver til en fibrinpolymer (da den består af flere fibriner), der er stor nok til at dække for området, hvor bruddet er opstået. Enzymet plasmin bliver så produceret, for at nedbryde fibrinen, så der ikke dannes tromber (kilde nr. 13 side 90-93). Plasmin (ikke at forveksle med plasmid) nedbryder bl.a. både fibrin og thrombin. Plasmin starter som proenzymet plasminogen, som bliver produceret i leveren. Men efter bearbejdning af enzymet TPA (tissue-plasminogen-activator), hvor det afskærer fra plasminogenet mellem aminosyrerne Arginin[5]-551 og Valin[6]-552 (se figur 5 i bilaget), bliver plasminet sendt ud i blodet og til det påkrævede område.

Plasminet består af to disulfid bundne polypeptider, som er inddelt i en let og en tung plasmin kæde. Den tunge plasminkæde er afledt af amino-terminalen, som i tilfældet af plasmin er lysin-enden. Da proteiner er kodet efter mRNA og lys er en afkodning af en triplet eller codon, som er tre baser, må lys-enden bestå af enten AAA eller AAG. Den lette ende er derimod afledt af carboxyl-terminalen, men til gengæld er det den lette kæde, som har plasminets aktive center.

Ved mangel på plasmin kan der let opstå tromber, da der ikke er andet til at nedbryde fibrinet. (kilde nr. 18 og nr. 27)

Behandlingsformer

Inden for de fleste nuværende behandlingsformer, skal behandlingen helst ske inden for 4-5 timer, for at undgå hjerneskader. Hvis der går for lang tid inden behandlingen påbegyndes, kan der være blevet dannet et hjerneinfarkt[7], som der er næsten umuligt at udrede skaderne ved (kilde nr. 25). Dette gør også ankomsten til hospitalerne meget kaotiske, da det er så kort tid, at alt skal ske hurtigst muligt for at undgå fatale hjerneskader. Selvom at der er mulighed for at overleve apopleksi, er der ingen nuværende behandling, som med sikkerhed kan begrænse skaderne efter et hjerneinfarkt (kilde nr. 24). Selvom nogle dele af hjernen kan erstattes af andre, kan hjernens effektivitet stadig blive stærkt påvirket af den blotte tilstedeværelse af en blodprop.(kilde nr. 25)

De fleste hospitaler benytter sig af acetylsalicylsyre som første stadie trombolyse og febernedsættende middel. Acetylsalicylesyre (eller ASA) skaber en irreversibel hæmning af TXA[8]-dannelsen i trombocytterne. Dette hæmmer derved den videre udvikling af tromber, Fordi ved at hæmme TXA8 hæmmes blodpladeproduktionen, derved hindres tromben i at vokse yderligere. Acetylsalicylsyre virker som faste antagonister for TXA-dannelsen og derved virker de i hele trombocyttens levetid, som er 7-9 dage. Udover det hæmmer ASA også produktionen af stoffet prostacyclin (C₂₀H₃₅O₅), som virker som vasodilator[9] og som hæmmer ansamlinger af trombocytter. Så ASA virker både ved at hæmme blodpladeproduktionen og forhindre trombocytterne i at ansamles. (kilde nr. 12 side 88-89, nr. 17 og nr. 25)

Men pga. nedsat produktion af nye blodplader, kan længere tids forbrug eller overforbrug Af acetylsalicylsyre give blødningsproblemer, da blodet ikke vil størkne pga. manglende blodplader. Men også ved almindelig brug kan ASA give bivirkninger, som f.eks. kvalme og opkastning. Pga. bivirkningerne, er det sjældent at acetylsalicylsyre bliver givet rent. Ofte bliver det givet sammen med andre midler, som enten forebygger eller hæmmer bivirkningerne, som f.eks. dioyrodamol eller en kombination af clopidogrel og persantin. (kilde nr. 17, nr. 18 og nr. 25)

Acetylsalicylsyre bliver ekstraheret som salicylsyre fra piltræsbarken. Det gøres ud fra teorien om at når en syre og en hydroxyforbindelse mødes, dannes der en ester (som i dette tilfælde er ASA) og vand som en reversibel proces, altså en hydrolyse. Salicylsyre skal her reagere med eddikesyre. Men da syrer ikke kan reagere på samme måde syrer imellem (syrer vil afgive hydroner), må der bruges den anhydride form af eddikesyre, eddikesyreanhydrid, til omdannelsen. Det går forbindelse og erstatter salicylsyrens hydroxy-gruppe med en acetyl-gruppe og tilbage bliver acetylsalicylsyre og eddikesyre som en irreversibel proces (se figur 6 i bilaget). (kilde nr. 5 side 258-259 og nr. 15)

Det resterende af medicinen til trombolyse kan overføres gennem simpel intravenøs infusion[10], som ved akut myokardieinfarkt[11]. Det middel, som ellers bruges af de fleste hospitaler til trombolyse behandling, hedder recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA) eller kaldet som enzym alterplase, hvis handlenavn hedder actilyse. (kilde nr.15 og nr.20).

Alterplase

Alterplase er en kunstigt fremstillet udgave af TPA (tissue plasminogen activator). Så det virker som en faktor til at aktivere spaltningen af plasminogen til plasmin. Men selvom at der er tre enzymer i det hele, som går ind under betegnelsen r-TPA (alterplase, reteplase og tenecteplase), er alterplase stadig den mest brugte og anerkendte. Dette skyldes primært at man kender mest til alterplase og at det er det enzym med færrest bivirkninger (kilde nr. 12 side 90-93, nr. 15 og nr.20). Som andre TPA, behøver alterplase fibrin som cofaktor til at blive aktiveret, dvs. at omdannelsen af plaminogen til plasmin kræver tilstedeværelsen af fibrin (kilde nr.19). Men selvom at alterplase er bedst at bruge af de tre r-TPA, er der også visse begrænsninger for brugen af alterplase, f.eks. må det ikke bruges ved øjenpåvirkning med diabetes patienter. Dette kan forekomme, da øjnene er særdeles udsatte ved diabetes og patientens blods pH-værdi er ændret til et mere surt miljø i forhold til raske patienter. Den ændrede pH-værdi kan derved denaturere enzymerne, som derved enten ikke vil virke eller vil virke på andre måder med andre resultater.(kilde nr. 28)

Almindeligt TPA bliver dannet i de endothelle celler på blodkarvæggene, hvilket der bliver benyttet i fremstillingen af r-TPA (kilde nr.15). Som andre enzymer bliver det dannet ud fra mRNA, som står for messenger-ribunukleinacid. mRNA er en kopi af en DNA-sekvens, som både bliver produceret ved transskription[12] og translation[13] (kilde nr. 7 side 57-59). Dannelsen af enzymer sker ved translation, da der bliver dannet aminosyrerne, som er proteiners primære struktur, men der sker også en modificering af aminosyrerne inden af proteinet dannes. Modificeringen sker i endoplasmatiske reticulum (ER). I ER kan der både ske ændringer generelt ved aminosyrerne, som f.eks. glycosylering[14], hvorefter resultatet er glycoproteiner; eller der kan ske ændringer ved de individuelle aminosyrer, som f.eks. hydroxylering[15]. (kilde nr. 7 side 56-57)

Desmoteplase

Blandt de behandlingsformer, som stadig er under udvikling, er desmoteplase nok den mest lovende. Desmoteplase er en af de nyeste enzymer inden for kategorien r-TPA. Desmoteplase er et enzym, som udskilles i vampyrflagermusens (desmodus rotundus) spyt. Man havde siden 1932 vidst at vampyrflagermusen havde evnen til at kunne holde blod i flydende form: observationer af vampyrflagermusen viste, at den levede af blod, typisk fra kvæg, men at den var i stand til at drikke blod i flere timer af gangen. Dette rejste spekulation, da almindelige sår ville have dannet rose[16] på den tid. Men grundet vampyrflagermusens orale mikrobiologi med både andre bakterier og nogle sygdomme, er det svært at ekstrahere enzymet i sig selv. Men omkring 1991 havde man fundet 4 kodende DNA-sekvenser for TPA, hvilket var med til at bekræfte teorien om et muligt nyt TPA enzym. (kilde nr. 19)

Men da desmoteplase stadigvæk er så nyt et enzym, kan der ikke sige meget om det, da Lundbeck (som forsker i det), stadig undersøger enzymet på høje planer. Men det er i høj grad de nye r-TPA, som der bliver udviklet for tiden. Selv Lundbeck forskningen i dette enzym er så langt fremme, at det er på vej igennem den kliniske fase 3 undersøgelse med indtil videre positive resultater (kilde nr. 23). Den kliniske fase 3 (ud af 4) er med en stor befolkningsgruppe (300-3000) for at teste præparatets endegyldige vurdering.

Fremstillingen af enzymatiske medikamenter

Basis for enzymdannelse

Ved dannelse af enzymerne skal man huske på, hvordan proteiner og enzymer dannes. Det starter med en DNA-streng i cellekernen, som har en kode for et enzymatisk protein. Den streng bliver åbnet af et enzym. De to strenge er nu skabelonstrenge, hvorpå der sætter sig nye nukleotider i så det passer med de korresponderende baser (altså efter baseparringsprincippet), indtil at der nås en stopkode (ATT, ATC eller ACT). Disse nukleotider er RNA-nucleotider[17], som danner en komplementær streng til DNA-skabelonstrengen og bliver sammenkoblet med skabelonstrengen med enzymet RNA-polymerase. Når enzymet når hen til en stopkode og til terminator området, standser processen og RNA-strengen slipper skabelonstrengen hvorefter at DNA-strengene samles igen. Denne pre-mRNA-streng, som er dannet, består nu både af den kodende del (exons) og den ikke-kodende del (introns). Men inden at denne pre-mRNA-streng forlader cellekernen, klippes introns fra. Denne fraspaltning sker ved spliceosomer[18], som danner løkker af introns og derpå fraspalter dem. Der påføres også en cap-struktur i 5’enden[19] (en methyleret guanosin) og et adenosin i 3’enden. Den resulterende streng er nu en mRNA (messenger-RNA). Denne proces var transkriptionen.

Efter den proces er overstået, begynder translationen, hvor aminosyrerne bliver ”oversat” til proteinerne. Efter at mRNA har forladt kernen, finder det vej til ribosomerne, som findes frit i cytoplasmaet eller på ER. Ribosomerne aflæser mRNA’et og sammenkobler med en anden form for RNA kaldet tRNA. tRNA består af et anticodon (en triplet/codon, som modsvarer trebaser på mRNA-strengen) og en aminosyre, som modsvarer den genetiske kode. Efter tRNA har afleveret codonet til mRNA, bliver det sendt tilbage til andre ribosomer, som sætter nye codon på. Denne proces fortsætter indtil der nås en stopkode. Så er der dannet en aminosyre kæde. Efter dette bliver de modificeret i ER. Men sådan forløber processen kun i eukaryote celler (Animale, humane og vegetations celler, samt svampe). De prokayote celler (bakterier) mangler mange af organellerne, som eukaryoter har, så de er nød til at kopiere direkte fra DNA til mRNA og så til proteiner (kilde nr. 7 side 58-59, nr. 10 side 206-207, nr. 21 og nr. 24).

Basis for Gensplejsning

Det første, som man skal huske ved gensplejsning, er, at det ønskede gen kan komme til udtryk. Det gøres ved at det ønskede gen, som skal komme til udtryk, har to andre sekvenser i hver sin ende: en start sekvens (promotor) og en stop sekvens (terminator). Dette kaldes for et ekspressionssystem. For DNA’s vedkommende vil start sekvensen hedde TAC og slut sekvensen vil enten hedde ATT, ATC eller ACT. Men for mRNA’s vedkommende vil startsekvensen hedde AUG, da de svarer til de korresponderende baser og slut sekvensen UAG, UAA eller UGA (igen: som korresponderende basepar) (se figur 7 i bilaget) (kilde nr. 7 side 56-57 og nr. 10 side 78-80).

Det er selve genet, som skal komme til udtryk, men der skal også noget til for at få ind i cellen på den rigtige måde: en celle har en masse proteiner i membranen, som enten kan virke som kanaler eller som receptorer, alt efter opbygning, struktur og placering. Men det er også muligt for nogle stoffer at benytte sig af simpel diffusion[20]. Udover det kan cellen også være udsat for osmotisk ubalance[21], som forårsager en udveksling af stoffer, så cellen kan passe til miljøet (kilde nr. 20). Det er ved brug af det, at ekspressionssystemet kan komme ind i cellen og dette faktor kaldes for en vektor (kilde nr. 10 side 78-80). Typisk er vektoren et plasmid fra andre prokaryoter, da de virker godt over for hinanden og let kan trænge ind i nogle membraner (kilde nr. 10 side 78-80). Det vil få cellernes kanaler til at åbne sig og lukke væske ind i cellen, hvorved ekspressionssystemet er inde i cellen.

Så kommer vi til selve gensplejsningen: her ser vi først på prokaryote celler, da deres plasmid er lettere at bearbejde. Plasmid er bakteriers cirkulære DNA streng. Grundet deres cirkulære form og deres lille antal eksemplarer per organisme, er plasmid lettere at benytte end eukaryot DNA. Plasmid består af en del forskellige sekvenser, ligesom eukaryot DNA, men også længere sekvens områder, som fremvist på figur 8 i bilaget. Som forklaret ved figuren består plasmidet af en ori sekvens, som den benytter sig af ved DNA-replikation. Men det er også fremvist, hvilke plasmid-sekvenser som er promotorer (Pamds) og terminatorer (Tamds). Ved gensplejsningen arbejder et restriktionsenzym på at klippe i steder på både plasmidet og genet, så genet kan indsættes i plasmidet. Derefter kan genet sættes sammen med plasmidet, vha. forlængelser af en af de to DNA strenge, som passer til forlængelsen af en anden DNA streng med de antal baser og de korresponderende baser på. Dette kaldes også for ”sticky ends” (klistrede ender på dansk) og der det samme, som man også bl.a. benytter sig af ved PCR (kilde nr. 10 side 76). Men for at DNA-strengenes sticky ends kan ”klistres sammen”, behøver man tilstedeværelsen af enzymet ligase. Efter at ligase har bundet enderne sammen, har man et plasmid med et integreret gen.

Men plasmidet skal også ind i værtscellen. Det kan ske på tre måder: ved transformation, konjugation og transduktion. Ved transformation modtager en prokaryot celle nogle DNA-sekvenser fra en anden organisme (kan både være pro- og eukaryot), som er død. Transformation kan også foregå, hvis der er frit DNA i omgivelserne. Men denne proces foregår dog kun hos prokaryoter.

Konjugation er overførelse mellem bakterier via et proteinrør. Ved denne proces danner donorbakterien et proteinrør (sex pilus på latin), som danner forbindelse med en anden bakterie og de trækkes tæt sammen. Det er gennem den bro, at overførslen af enten plasmider eller endda bakteriekromosomer foregår. Konjugationen kendes bl.a. for E.coli.[22] bakterier. Men som ved transformationen foregår dette kun mellem prokaryoter.

Transduktion foregår gennem bakteriofager, dvs. ved at en virus inficerer en celle. En bakteriofag inficerer en celle og får den til at producere flere bakteriofager, hvorved de indeholder DNA fra den inficerede celle. Nogle af dem indeholder det rigtige gen og andre indeholder de resterende gener fra cellen. Det er så de nye bakteriofager, som benyttes, da de også overfører det optagede DNA fra de tidligere inficerede celler. denne metode benyttes både udelukkende med enten eu- eller prokaryoter eller med både og. Det er typisk transduktion, som man benytter sig af ved gen overførsel eller anden genterapi (kilde nr. 3, nr. 8 side 216-217 og nr. 12 side 42-43).

Men selvom at alt dette er sagt, der er ikke nogen garanti for at proteinet er perfekt foldet med den rigtige sammensætning af aminosyrer med de helt rigtige sidegrupper på lige efter processen. Det kræver lang tid at finde frem til den rigtige måde at modificere proteinerne på, finde frem til de rigtige koder, hvordan de skal foldes, hvilke værtsceller og overførselsmetoder som er bedst at benytte mm. Det er primært derfor at det tager så lang tid for et medikament at lave. Det kræver tid at danne det perfekte protein. Og når man først har fundet det protein, som passer bedst med kombinationen af aminosyrer for enzymet, så skal man også se efter om det nye protein har samme virkning som originalen og derefter skal man tænke på, hvordan man oprenser det (kilde nr. 10). Med andre ord kan produktionen af enzymer godt være at bryde sit hoved med den gordiske knude, men uden den helt lette løsning ved hånden.

Inden forslagene

Der er et krav til alle de muligheder, til hvordan man kan lave de rekombinante enzymer. Alle mulighederne kræver enten en DNA-sekvens, som er bygget på enzymets/enzymernes opbygning. Dette vil ske gennem revers[23] translation. Modsat de andre DNA og protein processer, samt revers transskription, er revers translation ikke nogen bioteknologisk proces. Den bygger på først at analysere enzymets primære struktur[24]. Derfra har man en ca. afkodning af enzymets primære struktur. Jeg siger ca., fordi at den præcise fortolkning af aminosyrerne er svær. Det skyldes at 32 % af codonerne kan havde 4 forskellige tredje baser, 52 % kan have to forskellige tredje baser, 4 % kan have tre forskellige tredje baser og kun 12 % har en tredje base. I alt svarer det til at 88 % af codonerne kan have mere end en tredje base (se figur 7 i bilaget). Gennem computer animationer og -analyser kan man danne overblik over den primære proteinstruktur og også over DNA’et fra den pågældende organisme, som man gerne vil have enzymet fra. Når man har et overblik over både proteinets- og aminosyrer- sammensætning samt DNA’ets basesammensætning, vil man kunne sammenligne proteinets struktur med DNAets korresponderende struktur for at finde den sekvens, som minder mest om DNA’ets (kilde nr. 16).

Men nu har vi identificeret den DNA-sekvens som koder for enzym proteinet. Nu skal det isoleres. Men først starter vi med at ekstrahere DNA’et fra dyret. Det biologiske materiale, som vi skal have ekstraheret DNA fra, skal være fast. I dette tilfælde kan vi kalde det biologiske materiale for faktor Q_a. Først laves der en opløsning af 3 g NaCl[25] og 10 ml almindeligt opvaskemiddel (det ikke-koncentrerede), hvorefter at der fyldes op med 100 ml destilleret vand. Herefter skæres 100 g af faktor Q_a i tern af 5 mm i kantlængden og blandes med NaCl-opvaskemiddel-opløsningen, som blandes og røres. Når dette er gjort, sættes blandingen over i et vandbad på 60^o C i præcis 15 minutter. Alt dette vil opløse cellemembranen hos faktor Q_a. Det foregår ved at opvaskemidlet danner komplekser med cellemembranens phospholipider og proteiner. Det sker ved at nogle metalioner[26] i opvaskemidlet og lidt flere ligander, som i de fleste tilfælde er ammoniak/aminogrupper (NH₃ eller R-NH₂) eller H₂O bindes til lipiderne/proteinerne. En vigtig egenskab hos liganderne er, at de skal have ledige elektronpar (kilde nr.11). I dette tilfælde kan det ved proteinerne være enten ved aminosyrernes aminogruppe (-NH₃) eller ved deres carbonylgruppe (R₁-C=O-R₂), i forhold til de frie elektronpar hos N og O. Na⁺-ionerne i saltet vil binde sig til de negativt ladet phosphatgrupper på DNAet. Mens dette sker molekylært, denatureres også eventuelle enzymer, som nedbryder DNA’et hos faktor Q_a (såkaldte DNAser), omkring de 60^oC. Efter det varme vandbad, føres blandingen over til et isbad under stadig konstant omrøring. Dette skal til, for ikke at selve DNAet bliver nedbrudt samtidigt, da også DNA’et kan blive nedbrudt ved varmen over længere tid. Der skal det være i 5 minutter, hvorefter at det skal blendes i 5 sekunder ved høj hastighed, for at nedbryde cellemembranerne endnu mere. Men de 5 sek. SKAL overholdes for ikke at ødelægge DNAet. Så er cellemembranerne hos faktor Q_a’s celler nedbrudt og DNAet er frigjort. Dette filtreres så (her kan kaffefiltre bruges), hvor skum undgås. I det filter har man så ekstraktet fra faktor Q_a. Men DNAet skal adskilles fra ekstraktet. Det gøres ved at 6 ml af ekstraktet tilsættes 9 ml 96 % iskold ethanol, som ligger OVENPÅ ekstraktet UDEN AT DET BLANDES! Ekstraktet indeholder stadig nogle cellemembrandele og proteiner fra både celler og membraner. Ethanolen kan opløse cellemembraner og forstyrre proteinerne, men kan ikke opløse DNA, som vil flyde op til overfladen af ethanolet, hvor det vil ligge sig som noget hvidt materiale, som næsten ligner bomulds-vat (se figur 9 i bilaget). Det kan man evt. tage med spatel (kilde nr. 29). Så har man friske, rene DNA-prøver fra faktor Q_a.

Men så skal vi have udvundet den rigtige DNA-sekvens. Til det vil jeg foreslå at benytte sig af PCR[27] metoden. Jeg forslår denne metode, fordi at den dels opformerer DNA i det hele taget, men også at det kan opformere sekvenser af DNA, alt efter hvilke restriktionsenzymer som der er tilsat. Af komponenter til PCR-metoden bruges der en DNA-prøve, primere[28], nukleotider, DNA-polymerase, buffere[29] og endelig restriktionsenzymerne. PCR metoden fungerer ved skiftevis at hæve temperaturen til ca. 90^o C og sænke til ca. 60^o C. Når temperaturen stiger til de ca. 90^o C splittes DNA-strengene til to enkelt-strengede DNA, da hydrogenbindingerne[30]mellem DNA’ets baser brydes omkring de 90^oC. Efterfølgende sænkes temperaturen til de omkring 60^o C. Ved de omkring 60^o C sættes primerne på, hvorefter at DNA-polymerase efter primeren sætter ekstra nukleotider på det enkeltstrengede DNA. Men det er også her at restriktionsenzymerne virker og bliver sat i gang med at ”klippe” de steder, som passer med de indregistrerede koder, som enzymet skal klippe (eller bare ved de steder, hvor der er start- og stopkoder) (kilde nr. 7 og nr. 8). Når det er gjort, vil resultatet uden restriktionsenzymer (udover DNA-polymerase) være to identiske strenge (se figur 10 i bilaget), men med restriktionsenzym kan der godt komme flere strenge, som er identiske efter en tur, da restriktionsenzymerne klipper forskellige steder og mere end et sted på DNA-strengen. Dette kan give nogle problematikker med at finde det rigtige DNA blandt de andre DNA-sekvenser.

Her vil det være en god idé, at kende længden af den DNA-sekvens, som koder for det ønskede protein. Dette vil være en god idé, da resten af udvælgelsesprocessen er bygget på DNA-sekvensernes størrelse. For at adskille de lange og de korte DNA-sekvenser, kan man centrifugere[31] prøverne med DNA’et (kilde nr. 12). Det vil adskille de lange DNA-sekvenser fra de korte. Det kan give en fordel, hvis man

1. kender længden af både den vigtige DNA-sekvens og dels de afskårne sekvenser og
2. hvis ikke den vigtige DNA-sekvens har en længde, som minder om andre sekvensers længde.

Efter centrifugeringen af prøverne burde man kunne se en forskel i niveau af klarhed af væskerne. Den klare væske ovenpå er de korte sekvenser og den grumsede væske nedenunder er de lange sekvenser, da centrifugalkraften virker mere effektivt på større legemer. Hvis man kender længden af de afskårne DNA-sekvenser, kan man måske bestemme, i hvilket niveau, som man skal tage prøve fra. Men hvis restriktionsenzymet/-erne har klippet mere end én sekvens, kan det være et problem, da der så eventuelt kan være flere forskellige sekvenser med samme længde. Men hvis restriktionsenzymet er specielt tilpasset til at klippe den sekvens, som koder for lige præcist det ønskede protein, så kan sekvensen let blive udvalgt fra væskerne. Men hvis ikke der er givet udtryk for det i dette, så kan der være problemer med centrifugen alene, da den ønskede DNA-sekvens, måske kan have samme længde som andre DNA-sekvenser i prøven.

Men hvis produktionen hertil er forløbet efter planen og med forventningerne (hvilket det desværre mange gange ikke kan under forskning), så har man en DNA-sekvens, som koder for det ønskede protein, som kan foldes til det ønskede enzym.

Men hvis disse samlede ekstraktions- og rekombinations processer ikke virker, kan man benytte sig af copy-DNA-metoden. Denne proces bygger først på at mRNAet for et bestemt gen kan blive produceret ved at aktivere genet. I tilfælde med desmoteplase, kan aktiveringsfaktoren være tilstedeværelsen af fibrin. Derfra vil cellen (i dette tilfælde en celle fra vampyrflagermusens mund) producere mRNA. Det største problem her er oprensningen. Men når oprensningen har fundet sted, kan mRNA oversættes tilbage til DNA (eller cDNA) vha enzymet revers transkriptase. Revers transkriptase er et enzym, som findes hos virus typer med RNA, som arvemateriale som f.eks. retrovirus[32]. Når først det nye cDNA (copy-DNA) er dannet og tilført sticky ends, kan det også bruges til gensplejsningen (kilde nr. 10 side 76-77).

Men her skal der huskes, at de enzymer, som skal dannes, er kompliceret at danne og folde. Alene med dannelsen af proteinet kræves der translationer, som prokaryoter ikke kan, da de kun består af plasmid. Så der skal bruges eukaryoter til dette. Men også hos eukaryoterne stilles der krav: foldningsprocessen af proteinerne er kompliceret nok til at der kræves højt udviklede eukaryoter til at producere dem, da der skal særlige krav til organellerne, som folder proteinet. Det er lidt mere end f.eks. plante- og insekt celler. Derfor bliver der brugt mammale[33] celler til produktionen (kilde nr. 11 side 77-79). Men det svære nu er at få DNA-sekvensen ind i cellen, så den også kan komme til udtryk.

Første forslag

Det første forslag er at foretage en transformation med den mammale celle som værtsorganisme. Den fundne DNA-sekvens for proteinet tilsættes frit, hvorefter at der bliver tilsat en vektor, som får cellen til at ”åbne” sig og optage DNA-sekvensen. Vektoren vil nok være en saltopløsning, som svarer til et hypotonisk miljø i forhold til cellen (ikke for hypotonisk, da en celle også kan springes ved overtryk) (se figur 11 i bilaget), da det osmotiske tryk så vil være i overbalance til det udvendige miljø (kilde nr. 8 side 76-77).

Men med den teknik er der nogle problemer: for det første skal man finde det rigtige salt eller finde en måde, hvorpå at DNA-sekvensen ikke bliver påvirket af saltet. Men der ligger også nogle generelle problematikker ved denne metode: når cellen har fået indført den nye DNA-sekvens, vil det ikke være integreret i cellens DNA fra starten. Det vil flyde frit i cellens cytoplasma[34], og der ved kan det være et spørgsmål om DNA’et overhovedet vil blive bearbejdet af hverken ER eller golgi-apparaterne. Det er i hvert fald sikkert, at DNA-sekvensen ikke bliver integreret i cellens DNA, men så er spørgsmålet om det stadig vil blive bearbejdet. Men alene med visheden om at DNA-sekvensen ikke vil blive integreret ved denne metode, har man heller ikke sikkerheden med at cellen vil kunne producere enzymet.

Andet forslag

Det andet forslag omhandler en direkte indsætning af DNA-sekvensen i en celle inden mitosen indtræffer. Mitosen er den celledeling, hvorved celler deler sig. Mitosen består af 5 faser: interfasen, profase, metafase, anafase, og telofase. I interfasen er cellen endnu ikke begyndt at dele sig og kromosomerne kan ikke ses med endnu. Men så går det over i profase 1, hvor er blevet fordoblet og er fundet sammen parvis.. Herefter i metafase 1, hvor kromosomerne ligger sig i centrum af cellen. Membranen rundt om kernen er forsvundet, hvilket gør kromosomerne klar til anafase 1. i anafase 1 sker kromosomparene adskilt vha. tentråde[35] og centrioler[36]. Efter anafasen begynder den med endnu en metafase (en såkaldt metafase 2), hvorefter at de to faser gennemgås igen, indtil at der er fremstillet nye celler. men den fase, hvorpå at de deler sig igen, kaldes for telofasen (se figur 12 i bilaget). Indførelsen kan ske med en mikroglaskanyle, da det skal indføres direkte i cellen (kilde nr. 6 side 85 og nr. 8 side 36-37).

Men med denne teknik kan der være problemer. Her er der stadigvæk spørgsmålet om DNA-sekvensen vil blive integreret i cellens DNA-kode. Før denne teknik skal kunne lykkes, skal DNA-sekvensen allerede være en del af et kromosom, som derefter kan indsættes. Derfor skal kromosomet enten være godt konstruere eller man skal kunne overvåge processen. Der vil også være problemet, at pga. delingerne under telofaserne, vil DNA-sekvensen kun befinde sig i en celle, som med tiden kan dele sig mange gange og gøre det svært at identificere den rigtige celle. Denne proces vil desværre være besværlig med tiden, da et celle under udvikling kan gennemgå et utal af telofaser. Udover dette vil der også være etiske dilemmaer, da man benytter sig af et begyndende fosteranlæg. Men normalt begynder de etiske dilemmaer i disse sammenhænge først efter selve fosteret er blevet dannet.

Tredje mulighed

Den tredje mulighed bygger på at benytte sig af transduktion. Vi starter med at transformere en prokaryot med DNA-sekvensen. Selvom at det før er sagt at prokaryoter ikke kan danne så komplicerede enzymer, skal den prokaryote celle kun bruges som en midlertidig værtscelle. Dette skyldes, at retrovirusen optager noget af DNAet fra værtsorganismen og får den til at reproducere flere bakteriofager/vira. Det bakteriofager/vira vil så med tiden blive sendt videre enten med knopskydning[37] eller ved at springe membranen. Hvis bakteriofagerne/vira slippes fri med knopskydning, er virusset en kappevirus og derved gramnegativ. Hvis bakteriofagerne/vira sprænges fri, er virusset en nøgen virus og derved grampositiv (se figur 13 i bilaget). Det, som slippes fri, kan indeholde de rigtige koder for proteinet. Når den bakteriofag/virus inficere en ny celle, vil den celle være værtsorganismen. Retrovirusen virker ved at indsætte sine egne RNA-koder i værtsorganismens og får derved værtsorganismen til at producere og integrere sin egen sekvens, hvilket vil danne en celle, som har den indkodede sekvens fra den tidligere værtscelle, som i dette tilfælde kan have genet for proteinet. Denne metode bliver ofte brugt, når en eukaryot celle skal gensplejses med et gen fra en prokaryot. (kilde nr. 12 side 17-20+42)

Hvis ikke man har fået en modificeret udgave af retrovirusen, kan dette være temmelig farligt i den forstand at hvis man ikke passer på, kan man blive inficeret. Men sådan er det, når man arbejder med vira. Mit forslag hertil er at al arbejdet med selve viraene foregår så isoleret som muligt, uden at miljøet påvirker værtscellerne på en negativ måde. Ud over dette kan der også være et problem med at holde styr på, i hvilken af de bakteriofager/vira, som den midlertidige værtscelle har dannet, som indeholder sekvensen for proteinet. Det kan være et problem, da man så skal undersøge, om anden generations værtscellerne aktivere genet ved den pågældende metode, som normalt aktivere genet: som f.eks. tPA som aktiveres af fibrin. Det kan tage noget tid alt efter hvor mange bakteriofager/vira, som er blevet dannet ved første generations værtscellen og hvor mange af dem, som har inficeret andre celler. eventuelt om flere bakteriofager/vira kan inficere samme organisme, så der er kompetente vira. Men det sidste problem er at få stoppet retrovirusen ved anden generations værtcellerne, inden at den får cellerne til at producere bakteriofager/vira. Det er kun meningen at anden generations værtcellen skal producere det givne protein. Derfor må man sørge for at bakteriofaget/virusset kun overfører og integrere koden for proteinet. Det kan gøres enten manuelt (hvilket er besværligt og svært at konstatere hvornår) eller ved en særlig form for modificeret retrovirus.

Oprensning af enzymerne

Men enzymerne, eller proteinerne, er nu stadigvæk inde i cellerne. For at kunne få udbytte af dem, skal de oprenses. Der er mange måder til at oprense protein på. Nogle af dem minder om hinanden, mens andre specialiserer sig på andre punkter. En proces er gelelektroforese. Gelelektroforese går ud på at man lader protein- eller DNA prøver føres igennem en gel, som virker som en form for filter. Prøverne placeres i brønde for den ene ende af elektroforese apparatet, mens der i den anden ende er elektroder, som virker som positive poler over for de negative dele af DNAet. Mens prøverne vandrer gennem gelen, bliver større stykker af enten protein eller DNA efterladt længere tilbage i gelen, mens at mindre stykker søger langt ned i gelen. Dette sker efter teorien om at mindre stykker har lettere ved at passere gelens porer (kilde nr. 7 side 66-67). Denne proces bruges ofte i forhold til DNA-profiler eller ved genetiske sygdomme, hvor det kan påvises om patienten er syg eller rask (se figur 14 i bilaget). Men samtidig vil jeg fraråde denne proces til at finde og isolere selve DNA’et, da filteret kun går på længden af sekvenserne og at prøverne er svære at trække ud af gelen igen.

Man kan også benytte sig af søjlekromatografi (eller bare kromatografi). Ved søjlekromatografi benytter man sig næsten af samme metode, som ved gelelektroforesen, men i stedet for gel og forskelligt ladede poler, benytter søjlekromatografi sig af fældning og andre filteringsstoffer. Metoden gennemføres ved først at tilsætte proteinopløsningen ved injektion i toppen af søjlen, hvorefter at der pumpes en buffer igennem søjlen med materialet. Bufferen er med til at holde proteinopløsningens konstante pH-værdi. Proteinopløsningen med buffer siver ned igennem søjlematerialet, hvorved nogle af proteinerne forsinkes eller bindes nogle steder i søjlematerialet alt efter hvilket søjlemateriale der bruges. Når denne væske har løbet igennem søjlen, passerer den en detektor, som løbende måler de passerende proteiner (kilde nr. 30) (se figur 16 i bilaget). Ved søjlekromatografi kan man benytte sig af søjlematerialer, som binder forskellige ekstra tags[38] til sig. Som tags kan der bl.a. bruges en histidinhale, som består af seks eller flere histidin[39] koder. Søjlematerialet ved histidin kan være nikkelioner (Ni²⁺). Histidin har større tilbøjelighed til at binde sig med nikkelionerne (det har en større affinitet) og derved hænge fast tidligere i stoffet. Man burde så kunne ekstrahere prøverne ved enten at nedbryde affiniteten mellem Ni²⁺-ionerne og histidinet eller klippe histidin halen fra (kilde nr. 10 side 56 og nr. 11 side 80). Men det kan være et problem med histidinhalen, da man enten skal finde restriktionsenzymer, som udelukkende klipper histidin halen af eller som klipper en lille smule af koden fra histidinhalen. Hvis der kun bruges et restriktionsenzym, som reagerer udelukkende på histidin generelt, vil strengen også blive spaltet nogle steder, da der også er histidin andre steder i strengen end bare ved halen. Enten det eller der tilføres noget, som f.eks. Cl^– eller O^2- el. lign., som vil danne salte med Ni²⁺-ionerne. Men modsat de førnævnte metoder, så har søjlekromatografien færre problemer, som ikke kan løses. Det største problem er nok præcist at kunne genkende det ønskede protein efter processen, men det er en bagatel, da man kan sammenligne med sine gemte data fra den reverse translation. Men modsat gelelektroforesen er der flere muligheder for søjlemateriale alt efter, hvad man går efter (se figur 17 i bilaget).

Identifikation af genet

Det er også vigtigt at kunne fastslå, hvordan genet er opbygget. Til det er der også en række metoder, som kan benyttes ud over PC-scanning.

Man kan også benytte sig af en Edman-degradering. En Edman-degradering går ud på at man binder et phenylisothiocyanat til animogruppen med et af aminosyrens aminogruppes H-atomer, som sætter sig på phenylisothiocyanatets N-atom og danner derved et ledigt par hos dets C-atom, som binder sig til aminogruppens N-atom (se figur 17 i bilaget). Derfra kan en pH-ændring ved syrebehandling få den aminosyre, som phenylisothiocyanatet har sat sig på, spaltet fra resten af kæden. Den proces gentages så, indtil at alle aminosyrerne er adskilte. De fraspaltede aminosyrer kan blive identificeret ved kromatografi. Men problemet med denne proces er, at den ikke virker så godt på større proteiner, fordi at det vil tage for lang tid og derved at der er en chance for at kæden dannes igen. Men den er effektiv til at bestemme så mange aminosyrer at det kan oversættes til DNA. Men det har vi allerede fra tidligere og er derfor ikke nødvendig (kilde nr. 10 side 58).

Men det er den primære struktur, som kan identificeres med Edman-degradering, men så mangler vi stadigvæk både den sekundære[40], den tertiære[41] og den kvarternære[42] struktur. De er også vigtige for et enzyms funktioner, da alle enzymer bl.a. skal have reaktive centre, som er foldede, så substraterne kan være i dem. Det er særlige udfordringer at finde alle de tre førnævnte strukturer, da der kan være så mange variationer af dem. Dette kan måske i nogle tilfælde klares med røntgenkrystallografi. Det sker ved at proteinopløsningen bliver tilført en passende saltopløsning, som krystalliseres. Saltopløsningen kan variere fra protein til protein. Blandingen krystalliseres ved at fordampe vandet. Dette vil indkapsle proteinerne i saltkrystaller, som kan gennemlyses med røntgenbølger[43]. Ved gennemlysningen afbøjer røntgenstrålingerne sig, da lysets elektroner erstatter nogle af aminosyrernes elektroner i deres yderste skal og bliver sendt videre i en anden retning (som et spil kugler). Afbøjningen og intensiteten af lyset, som kommer ud på den anden side af krystallerne, afhænger af antallet af elektroner i proteinets atomer og eventuelt interferens mellem røntgenbølgerne. Derfor kan man skelne mellem atomer og afbøjningerne vil tilsammen afspejle atomernes placering mellem hinanden. Man placerer derved en røntgenfilm bagved, som afbøjningsmønstret danner et billede på. For at få andre vinkler af proteinerne vist, skal man blot dreje krystallerne (kilde nr. 10 side 58-59). Men denne proces kan være svær at benytte sig af alene, hvis man ikke kender proteinets/proteinernes primære struktur. Selvom at det siges at man ikke kan bestemme et proteins sekundære eller tertiære struktur ud fra den primære, kan man dog godt identificere et loop ved den primære struktur. I den primære struktur har codonet cys[44] tendens til at danne svovlbroer mellem hinanden. Da det kan hænde, at der kan gå et vist antal codon før at cys nævnes igen, vil der ved dannelsen af svovlbroen blive dannet et loop, som en lykke dannes på en snor (se figur 18a og 18b). MEN selvom at metoden måske kan afsløre et proteins sekundære, tertiære og kvarternærer struktur, skal man være FULDSTÆNDIG sikker på at man kun befinder sig med det rigtige protein i sin blanding for ikke at blive forvirret ved røntgenbilledet. Men jeg kunne heller ikke finde så meget andet om denne metode, så jeg vil ikke sige, at denne metode er perfekt at bruge til at bestemme et proteins andre strukturer. Jeg vil hellere benytte mig af computer animationer af de andre strukturer end at jeg ville starte med at benytte mig af denne metode.

Konklusion

Dannelsen af tromber kan betragtes som en livsstilsygdom, da mange af tilfældene er grundet kolesterol aflejringer på indersiden af blodårene og/eller fibrin overproduktion. Der er nogle mekanismer, som enten hæmmer eller nedbryder disse tromber. Det er også disse mekanismer, som den medicinske behandling går ud på at aktivere eller katalysere. Blandt faste medikamenter benyttes acetylsalicylsyre ofte, men sjældent uden noget, som kan hæmme bivirkningerne, da de kan være kraftfulde.

Der er en del at forske i stadigvæk både med enzymerne som trombolyse behandlende midler, men også bare ved produktionen af dem. Enzymerne virker som tPA-aktivatorer, hvilket er et fremskridt i undersøgelserne. Men det er en god ting at de stadigvæk forsker i enzymerne, da det kan have bivirkninger ved et for højt indhold af plasmin i blodet. Deres effektivitet vil være en ting, som jeg vil sige at der skal forskes i, men også lettere og mere succesfulde produktionsmetoder: revers translation er både langtidsvarende, hvilket kan føre til fejl. Samtidig giver det kun billedet af proteinets struktur. Måden at ekstrahere DNA fra en organisme virker kun ved fast organisk materiale. Ved PCR skal man finde netop de restriktionsenzymer, som reagerer på den specifikke kode, for ikke at der bliver problemer med længde og kode mm. Idéen med at centrifugere det opformerede DNA nytter kun, hvis man kunne finde de rigtige restriktionsenzymer til brug ved PCR. Mens samtidig ville det være et problem, hvis der var flere sekvenser, som minder om den bestemte kode, da der så vil være flere koder med den samme længde. Den egentlige måde at få koden for proteinet på er ved revers transkription. Den er kortere varende og har knap så mange problematikker med sig.

Så er der hvordan man får integreret den fundne DNA-sekvens ind i den rigtige værtscelle. Det første forslag til integreringen af DNA-sekvensen virker godt nok til at kunne komme ind i cellen, men jeg vil kalde denne metode for usikker, da det er tvivlsomt om frit DNA i cytoplasmaet vil blive integreret eller bare indgå i transskription og efterfølgende translation. Den anden mulighed med at indfører DNA-sekvensen manuelt direkte ind i en celle inden mitose er igen god nok til at få DNA-sekvensen ind i cellen, men den vil ikke blive integreret i kromosomernes koder. Det bedste, man kan håbe på med denne metode, er at koden vil blive kopieret til post 1. generations cellerne, men det er ikke noget stort. Så er der den tredje mulighed med brugen af transduktion med en retrovirus. Den lyder mere brugbare og sikker, men man skal være opmærksom på at stoppe retrovirussens adfærd så snart DNA-sekvensen er integreret i 2. generations værtscellens DNA.

Oprensningen kan der også arbejdes på, da de to angivne processer faktisk har sine problemer også: ved gelelektroforese er der ikke nogen anden filtreringsfaktor end længden af proteinerne, samtidig med at man har svært ved at ekstrahere prøven igen. Ved søjlekromatografi kræver det virkelig at man kan finde et affinitions tag, som kan passe på netop det protein og finde en faktor, som kan binde det. En ting er at finde søjlematerialet, men noget andet er at få fundet et tag, som der kan bruges ved det udvalgte protein.

Selv identifikationen af proteinernes strukturer har sine problemer. Edman-degraderingen virker bedst ved kortere kæder og kan give et virvar af et aminosyre-mix, når processen har kørt et par gange. Og samtidig ved røntgenkrystallografi er der teori, som mangler og man skal supplere med den primære struktur. Dette kør den til en usikker metode at bruge.

Med alt dette sagt er der potentiale ved brug og fremstillingen af enzymerne, da trombe dannelsen kan betragtes som en livsstilssygdom, som følger med livet og hverdagen i den postmoderne verden. Hvis denne forskning går som de skal og enzymerne bliver godkendte og sendt på markedet, kan man måske rede mange reelle menneskeliv ved disse nye medikamenter. Jeg er også glad for at forskerne på de nye medikamenter har en større viden om emnet og mulighederne end jeg har. Hvor der er vilje er der vej, derfor håber jeg også på at disse medikamenter kan blive produceret og udviklet rigtigt, så man kan danne en ny vej for livet.

Litteraturliste

Bilag

Figur 1) Her ses, hvordan dannelsen af embolier sker i endothel laget på indersiden af blodkarene. i det sidste billede er bindevævet dannet af LDL-kolesterolet (figur 1 side 106 fra kilde nr. 9)

Figur 2) her ses hydrolysen af fibrinogen. De kugle formede proteiner, som kæderne Aα-, Bβ og γ sidder på, kaldes for område D, mens mødepunktet mellem proteinerne kaldes område E. (figur 57 og 58 side 91 taget fra kilde nr. 12)

Figur 3: her ses processen fra fibrinogen til det færdige fibrinpolymer. De røde streger er bindingerne mellem D og E fragmenterne. (taget figur 59 side 92 fra kilde nr. 12) 

Figur 4) her ses reaktionen fra plasminogen til plasmins reaktion med fibrin. plsminogen activator inhibitor 1&2 aktiverer tPA og urokinase og faktor XI_a , XII_a og kallikrein katalysere reaktionen. Mens α₂-antiplasmin og α₂-macroglobulin hæmmer produktionen og virkningen af plasmin. (taget fra kilde nr. 27 ) 

Figur 5) her ses så processen ved omdannelsen af plasminogen til plasmin. Det lille grønne område i plasminogenet er signal peptidet. Det bliver så det første, som bliver fraspaltet, så det bliver til Glu-plasmin (med glu-codonet som udgangspunkt). Dernæst bliver aktivator peptidet fraspaltet, så det er det færdige lys-plasmin. (taget fra kilde nr. 18) 

Figur 6: syntesen af acetylsalicyl fra salicylsyre. Det er en hydrolyse, da restproduktet er vand. Processen er irreversibel, da to syre ikke direkte kan danne nogen reaktioner. (billedet er selv lavet, men ud fra figuren på side 259 fra kilde nr. 6)

Figur 7. hjul for codon sammensætninger med betegnelser. Definitionen af et codon kan fortolkes: man begynder i centrum, hvor man vælger startbase. Derfra går man til den inderste ring, hvor man vælger, hvilken baser der kommer efterfølgende. Så er man i den næst yderste ring, hvor der står mere end et tegn. Det skal fortolkes så den sidste base er en af de angivne i den ring ud for det felt, som man kom fra, f.eks. kan DNA val (valin) både være GTG, GTT, GTA og GTC. Derudover passer baserne sammen, så den ene base i centrum, som er skråt overfor den anden base i centrum, er deres begges korresponderende baser: A har den korresponde base T (eller U for RNA) og omvendt, mens G har den korresponde base C og omvendt. A=adenin, G=guanin, C=cytosin, T=thymin og u=uracil. (figure 7 fra side 56 fra kilde nr. 7 )

Figur 8: her ses en udgave af plasmidet pToC90. plasmidet er her inddelt i 7 hovedområder, hvor der er to områder, som er urørt. Dette plasmid er blevet gensplejset: det tilførte gen er amdS, som har promotoren Pamds, og terminatoren, Tamds (de er faste ved plasmid gensplejsning). Amp er her et inaktivt resistensgen, som stammer fra de originale plasmid og endelig ori, som er en kopi af det originale plasmid. Ori bruges ved replikation, som et bindingspunkt for DNA-polymerase. Pilene angiver genernes transkriptionsretning og tallene angiver baseparrenes nummer. (figur 42 fra side 79 fra kilde nr. 10) 

Figur 9. her er et lignende forsøg lavet, hvor man ville tage ekstrakt fra en kiwi frugt. Det hvide materiale mellem overfladen af den samlede væske og overfladen af ekstraktet er DNA-prøver, som ikke er opløst af ethanolet. (taget fra kilde nr. 29b).

Figur 10. her vises, hvordan PCR metoden virker. Når temperaturen stiger til 90^o spaltes DNA-strengene og ved 60^o bliver der sat primere og nye nukleotider på. Men hvad, der ikke er markeret, er, at andre restriktionsenzymer også virker ved den 60^o. Det er også noget af det, som benyttes til at opformere DNA, som er fundet på gerningssteder fra en morder, hvis der ikke er tilstrækkeligt med det på gerningsstedet. (figur 18 side 65 fra kilde nr. 7).

Figur 11. her ses celler i tre forskellige saltholdige miljøer: hypotonisk: hvor indholdet af opløste stoffer (salte) i opløsningen, som cellen befinder sig i, er lavere end fysiologisk saltvand (svarer til 0,9 % NaCl); isotonisk: hvor koncentrationen af vand og salte i opløsningen, svarer til det samme inden i cellen; hypertonisk: hvor koncentrationen af opløste salte i opløsningen er højere end enten fysiologisk saltvand eller koncentrationen af opløste salte i cellen. Ved højere hypotoniske forhold end cellens normale miljø, vil vand trænge ind i cellen og den vil eventuelt springes. Ved højere hypertoniske forholdend cellens normale miljø, vil vand trænge ud af cellen og cellen vil blive lille og hård. (tegnet efter figur 5.2 på side 77 fra kilde nr. 8).

Figur 12: her ses en mitose med alle dets faser. Man kan se, hvordan kromatiderne bliver trukket fra hinanden i anafasen og hvordan cellekernemembranen bliver genoprettet igen i interfasen igen. Mitosen foregår kun når et fosteranlæg udvikler sig fra en zygote. (figur 121 side 85 fra kilde nr. 6).

Figur 13: her ses et eksempel på en nøgen virus (grampositiv) og en kappevirus (gramnegativ). Grampositive virus er mere modstandsdygtige over for fysiske påvirkninger, som f.eks. temperatur ændringer, mens gramnegative virus er mere modstandsdygtige over for kemiske påvirkninger, som f.eks. pH-ændringer. (figur 15 på side 18 fra kilde nr. 12). 

Figur 14: her ses en skitse af en færdig gelelektroforese, som har undersøgt et homozygot raskt (1), et homozygot sygt (2) og et heterozygot individ (3). Den raske homozygot har fået lavet udelukkende lange sekvenser, da der ikke er angivet nogle andre bånd end det ene næsten helt oppe ved brønden. Derimod har den homozygot syge flere korte sekvenser, mens at den heterozygote har alle tre bånd. Størrelsesmarkøren er en normal bruge ved gelelektroforese, som viser sekvenser af kendte størrelser (figur 22 på side 67 fra kilde nr. 7). 

Figur 15. her ses, hvordan søjlekromatografi forløber og er opsat. B er bufferen, som blandes med proteinopløsningen ved injektionsventil omkring punktet e. Derefter løber det igennem søjlen a og bliver løbende registreret i området uden for søjlen c+d. Efter passagen c+d skal blandingen, eller eluatet, opsamles så det ikke bare bliver smidt ud i naturen (ALTID HUSK DET!). Dataerne fra c+d kan så blive overført til en computer f, hvorefter man kan fortsætte det givne arbejde. ( kilde nr. 30)

Figur 16. her ses et skema over, hvilke søjlematerialer, som kan bruges, hvad princippet med de enkelte materialer er, hvad deres ligander er og endelig hvad gelmaterialet består af. Det givne eksempel, som jeg har givet i teksten, kan man se at det er en affinitetskromatografi, da man går efter proteiner, som bindes specifikt til andre stoffer i gelen. (kilde nr. 30).

Figur 17: her ses dels sammensætningen af phenylisothiocyanat (PITC), dels hvordan den sætter sig på peptiderne. Herfra gennem en pH-ændring, kan forbindelsen mellem den bundne peptids C-atom og resten af kædens N-atom. (kilde:http://www.biochem.mpg.de/lottspeich/technologies/edman_sequenzing/absatz_2_edman_degradation.pdf ) 

18a

18b

Figur 18a: her ses den primærestruktur af både stoffet oxytocin (til venstre) og ADH (til højre). Svovlbroen mellem cysteinerne sker, da cysteins radikal hedder R-CH₂-SH. Hydrogen-atomerne fraspaltes ved kontakt, hvorefter at svovlatomerne bindes og danner den samlede radikal               R₁-CH₂-S-S-CH₂-R₂. (figur 6 på side 53 kilde nr. 10).

Figur 18b: et stykke snor, som er dannet i en lykke, da to punkter i hver sin del af snoren mødes. Dette sker også ved dannelse af svovlbroen mellem cystein i en protein sekvens. (billede taget selv af mig, som folder en snor. Billedet er taget lør. D. 9/11 2011).

[1] LDL-kolesterol er den ene ud af to direkte kolesterol typer af lipider (den anden er HDL)

[2] et tynd lag af celler på indersiden af blodårer

[3] koagulation =blod forstørkende

[4] enzym, som skær i proteiners peptidkæder

[5] Arginin, som består af enten AG(G/A) eller CG(U/C/A/G)

[6] valin, som består af GU(U/C/A/G)

[7] Område, om pga. iskæmiske årsager dør og efterlader et område med døde celler. dødeligheden efter et hjerneinfarkt ligger på 20-25 % efter den første måned

[8] Tromboxan, som stimulere dannelsen af nye blodplader.

[9] Blodkar stimulerende middel.

[10] injektion i selve blodåren

[11] infarkt dannelse i hjertet pga. blodprop

[12] Dannelse af en RNA-kopi fra en DNA-streng

[13] Dannelse af aminosyrer af en RNA-streng

[14] Carbohydrater bliver tilkoblet til hver af aminosyrerne

[15] en OH-gruppe bliver påsat et C-atom.

[16] Sårskorpe

[17] Thymin (T) er udskiftet med uracil (U) og deoxyribose i DNA’s strenge, som holder phosphat og baserne sammen er udskiftet med ribose. Samt ændringer i codon definitioner

[18] snRNA(small nuclear RNA) med enzymfunktion, som er dannet ud fra en anden form for transkription

[19] både DNA og RNA har en 5’ende og en 3’ende, som sidder overfor hinanden i de to ender. På 5’enden sider der en phosphat gruppe på deoxyribosen, mens 3’enden mangler dette.

[20] Transport af stoffer over cellemembranen, som ikke kræver nogle kanaler eller noget energi. Sker typisk ved små, lipide molekyler.

[21] Uligevægt mellem koncentrationen af et stof uden for cellen og inden i cellen. Osmose forbinder man typisk med vand, men osmotisk ubalance kan også ske med andre stoffer i miljøet.

[22] Escherichia coli: kan både findes i tarme, som en god virksom bakterier, men skadelig i andre områder, eller som den type, som man f.eks. laver mælk og yoghurt af.

[23] Omvendt/modsat

[24] Aminosyrekædens sammensætning

[25] Almindeligt bordsalt

[26] det er typisk undergrupperne i det periodiske system, som f.eks. Mg²⁺ Ag⁺ eller Fe²⁺

[27] Polymerase chain reaction

[28] Korte nucleotidsekvenser med frie hydroxygrupper (-OH) i 3’-enden. Virker som startsekvens for den videre påsætning af nye nucleotider

[29] Stoffer, som virker som pH ”stødpuder”, så pH-værdien holdes konstant.

[30] Bindinger mellem et H-atom, som den positive ende, og enten et F-, O- eller N-atom, som negativ pol.

[31] At bruge centrifugal-kraften til at tvinge større molekyler længst ud i periferi i forhold til rotationen.

[32] Består af to enkelt strengede RNA strenge. Under kategorien retrovirus finder vi hiv/aids

[33] Pattedyrs celler

[34] Celle væske

[35] Protein tråde, som går fra centriolerne og hæfter sig fast på hvert sit kromosom i kromosomparrene

[36] En del af centrosomerne, som sidder fast i hver sin ende af en celle og bliver kun aktiv under mitose og meiose

[37] Bakteriofagerne bliver modnet og sendt videre ved at gå gennem cellemembranen og tage noget af det med.

[38] Eng. Mærkeseddel. Stoffer og koder, som kan markere et stof og kan hjælpe med til at hænge fast i nogle søjlematerialer. Sættes så de er sat på de specifikke koder.

[39] Codon og har baserækefølgen GTA/GTG hos DNA og CAU/CAC hos RNA.

[40] Hvordan selve aminokæden er udformet. Der kan være tale om α-helixer, β-foldeblade, turns, loops og bends i denne struktur.

[41] Hvordan den samlede streng med alle bends, loops mm er foldet sammen til en ”proteinklump”

[42] Hvordan proteinklumper ligger i forhold til hinanden i et protein. Dette sker, da mange proteiner er sammensat af underenhedsproteiner.

[43] Lys med en bølgelængde på mellem 30 PHz til 60 EHz

[44] Cystein: har kodningen ACA/ACG hos DNA og UGU/UGC hos RNA.